做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！

做好Western需要注意各种细节。工欲善其事，必先利其器，首先还是从蛋白提取开始谈起。

1.收样前3min先配制细胞裂解液（现配现用），RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，计算用量。以收集六孔蛋白为例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制剂12ul，磷酸酶抑制剂12ul，混匀后置于冰上。（我使用的试剂RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制剂混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制剂混合物（100×）均购自***公司）
2.弃掉旧的培养基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul刚配好的裂解液，立即置于冰上，在摇床上裂解30min。

（全程在冰上操作）
1.将动物组织（脑、肺等）取出后分装成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份备用），取出后立即存于-80℃。（注：取完一块组织后立即冻存于-80℃，反复冻存样品对待测蛋白有影响，最好用新鲜样品实验）
2.配制细胞裂解液（现配现用），组织:RIPA=1mg:10ul，可根据实际情况调整。RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=99:1:1。配好后置于冰上。
3.将其中一份组织剪下约90mg于有钢珠的震荡匀浆器中匀浆。此匀浆器的盖子或芯通常置于-20℃，使用时取出，操作应快捷，匀浆1min基本可保持温度。
4.将匀浆加入90ul现配的裂解液中，冰上摇床裂解30min。

我采用的是***公司的BCA蛋白定量试剂盒测定提取蛋白浓度，和说明书protocol差别不大，稍有不同，如下：
1.稀释BSA标准品以制作标准曲线：取7支EP管，每管加30ul生理盐水，第一管加30ulBSA，混匀后再取30ul至第二管，依次倍比稀释，最后一管不加为空白（即本底值）。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。

可提前配制：

戴好口罩和手套，选用1.0mm玻板，用试管刷和洗洁精仔细刷洗玻板，清水冲洗干净。卡槽对齐卡好后置于软橡胶垫片上，夹紧，向板中加满蒸馏水试板子是否漏液。观察几分钟后若不漏液，将板子中水倒出，倒扣晾干。

1.配制8ml 10%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml，1.5M•pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混匀后立即灌胶，用1ml枪头沿着玻板上沿从左至右轻轻将胶打入，以免胶浓度不均匀，避免气泡产生。加完后换200ml枪头从左至右更加小心加入蒸馏水水封，以免冲散刚灌的分离胶。静置，当水和胶之间出现一条水平的折线时，即已凝固。
2.待分离胶凝固后，将水封的蒸馏水倒出，可将滤纸条放于玻板角吸水加快残留水流出，倒置。配制4ml 5%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M•pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混匀后立即灌胶，同上用1ml枪头从左至右轻轻加入浓缩胶，加满后冲洗10孔梳子，水平轻轻插入浓缩胶中静置待其凝固。可将剩余的浓缩胶沿着梳子加入玻板中以完全密封。
3.此时，可将之前分装好的煮过的加入loading buffer的蛋白样品、预染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均为神经毒性、致癌物质，使用时需小心。
2.灌胶时视线与胶面水平，注意操作，避免胶溅入眼睛中。
3.常温下半小时胶可凝固，若天气寒冷或需加快凝固，可将其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑胶，这样就不耽误午饭时间，可头天晚上先把胶配好，凝固后取下玻板，连夹子、梳子一同放入蒸馏水中，4℃过夜保存。

1.将玻板卡紧电泳槽中，先在内槽加满已配好的1×电转液，十几分钟后观察是否漏液，若漏液重新调整玻板，再次卡紧，直至不漏液为止。否则，可能胶还没跑完，电转液就漏完了。
2.轻轻拔去梳子，第一孔加入5ul预染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待测蛋白样品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上样时轻轻加入，注意不要将样品加入其他孔，或加样过快导致样品溢出。
3.插好正负极，注意检查正负极不能插反。调节电压至80V（浓缩胶），跑0.5h后；将电压调至100V（分离胶），约1.5h后，maker分离明显，在胶底部出现一条蓝 {MOD}的buffer条带，此时电泳完毕。使用完在实验仪器使用本上做好登记。
注意：避免蓝 {MOD}条带跑出分离胶，这样有可能目的蛋白也已经跑出，所以在分离胶底部出现一条整齐水平的蓝 {MOD}条带时，即停止电泳。
Little Trick
1.电泳时插好正负极后，从电泳槽底会有小气泡上升，气泡的数目和上升速率与电压大小呈正比。若小气泡和往常不太一样，观察几分钟后还是如此，则需检查是否加错了电泳液，或者电泳液配制有误。
2.一般浓缩胶80V 0.5h，分离胶100~120V 1~1.5h，具体跑胶电压和时间与目的蛋白大小、实验仪器和实验室环境都有关，需多次探索最佳条件。若目的蛋白较小，则尽量缩短跑胶时间，并及时观察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分别实验了浓缩胶80V 0.5h，80V 1h，分离胶120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，结果显示在本实验室实验仪器下，我的目的蛋白及内参在浓缩胶80V 0.5h，分离胶100V 1.5h条件下，分离效果最好。在此条件下，我做了几次重复实验，结果均一致。因此，总结出本实验室此目的蛋白的最佳电泳条件。
3.电泳的好坏直接影响到目的蛋白的显影情况，尤其时磷酸化目的蛋白的二聚体，若电泳条件优化，结果可清晰显出蛋白表达情况。所以探索最佳电泳条件是决定胜负关键一步。
4.电泳快结束时即可准备转膜所需的滤纸和PVDF膜，浸泡在电转液中。建议在第一次WB后分别剪好不同大小的硬纸片，标好面积和孔数（即样品数），存好以后随时使用。
5.WB中夹取PVDF膜最好使用平头镊子，并夹住膜左上角，可最大程度减小对膜上蛋白的损害。

电泳结束后，取出玻璃板，稍微冲洗，洗净电泳槽，放好。轻轻撬开玻璃板，根据maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切胶，为了防止切歪，可在玻璃板下垫上上述剪好的同切胶大小一致的硬纸片。一般一块胶需切下目的蛋白和内参两小块胶，将切下的胶分别浸泡在电转液中。

1.根据每一块切胶的大小剪6张同样大小的滤纸和一张PVDF膜，浸泡于电转液中，可以提前准备好的硬纸片为模板剪。PVDF膜先经甲醇活化20s后浸泡于电转液中。
2.在电转仪上制作“三明治”结构转移膜，最下面放三层滤纸，然后依次放PVDF膜，胶，三层滤纸，用玻璃棒轻轻赶走气泡（注意上下三层滤纸之间不能接触，否则易造成短路）。盖上盖子，根据膜的总面积调整电流，电转2h。
3.在电转的同时，可以配制以下液体，事先根据膜的数量计算好所需体积：
以一块膜为例，封闭5ml+稀释一抗4ml+稀释二抗4ml，需要13ml，则配制15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，称取0.75g BSA晶体，溶于15mlTBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存（若目的蛋白为磷酸化蛋白时配制）。
5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)，称取0.75g脱脂奶粉，溶于15ml TBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用时将100×TBST用双蒸水稀释至1×，常温保存。
Little Trick
1.关于电转膜，有些使用NC膜。我没有尝试过NC膜，但隔壁实验室使用NC膜多次WB结果仍不理想，换用PVDF膜后有所改善。因此建议还是使用PVDF膜，可购买Millipore的PVDF膜，一卷有些贵，但是可以够一个实验室用好几年哪。最好不要在经销商购买分装的的PVDF膜，另一实验室一同学想着价格便宜也就只做几次，就从试剂公司只买了100cm2的膜，结果这价格虚高不说，而且膜还是假的，直到做完实验了才发现，蛋白样品也浪费了。所以建议还是购买Millipore公司原装的PVDF膜。
2.关于电转方式，有些采用湿转，有些采用半干转，两种方式均可。个人觉得半干转方便简捷些。

1.电转结束后，根据maker位置和目的蛋白及内参大小剪膜。可在标有maker的一边左上角剪一个小角，以清楚哪一条带是1号样品。
2.分别用已配好的5% BSA和5%牛奶封闭目的蛋白和内参，室温摇床上孵育2h。根据盒子大小，加入封闭液的量需没过膜。

1.配制p-STAT1一抗（ 公司），1:500稀释，加入上述配制的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混匀，现配现用。
配制actin一抗（ 公司），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混匀，现配现用。
2.将PVDF膜从封闭液中取出，可用平头镊子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃过夜。我一般用封口膜做成小盒，置于大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用枪从上到下向膜上加一抗，完全浸没，之后和PCR上样仪一同固定在摇床上，4℃孵育过夜。

次日，回收一抗，做好标记，-20℃保存，可再使用3~4次。将膜放入1×TBST中，摇床上清洗三次，每次10min。

1.配制具有种属特异性的HRP标记的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混匀，现配现用。
2.TBST洗完膜后，加入二抗，室温摇床上孵育2h。

1.二抗孵育完后，回收，-20℃保存。1×TBST摇床上洗膜三次，每次10min。
2.一条目的蛋白即一张膜需要100ul发光液A和100ul发光液B，根据膜数计算用量，提前4℃混合好发光液A和B。
3.到暗室中加混合好的发光液，在胶片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光胶片，可分别不同时长曝光，如15s，30s，1min，5min等，然后在显影液和定影液中显影，放入自来水中。出暗室后，将胶片挂起晾干。
也可用Bio-rad凝胶成像系统照相，选择不同的曝光时间成像。
Little Trick1.需通过不同曝光时间探索某蛋白最佳曝光时间，多次重复实验即可采用此曝光时长。我最开始也是在暗室中显影，后来用Bio-rad凝胶成像系统照相，对比结果发现后者的结果更加清晰明显，背景也更加干净，之后就一直用成像仪曝光照相了。
2.夹取胶片可用普通镊子，但也只夹胶片左上角，避免损害胶片上曝光的蛋白条带。
3.胶片左上角maker一侧一定要剪一小角或做其它标记，才可在显影后明显对应各个样品。
4.若暗室曝光，可能内参蛋白发光液刚加上就出现很亮的条带，这时最长曝光15s已经足够。

若显影效果不好，可将膜重生，再次显影，省去了配胶、电泳和电转等步骤。
1.加4ml蛋白印迹膜再生液，室温摇床30min。